آزمایشگاه سلولی-جلسه اول
ساعت ٩:٢۸ ‎ب.ظ روز ۱۳٩٠/۱٢/٥  کلمات کلیدی:

برای مشاهده به ادامه مطلب بروید


آشنایی با میکروسکوپ نوری

استاد راهنما: فاطمه کاظمی

 

تاریخچه میکروسکوپ


میکروسکوپ (Microscope) یا ریزبین از دو واژه یونانی میکرو, به معنی کوچک و اسکوپ, به معنی دیدن گرفته شده است. قبل از اختراع میکروسکوپ در اواسط قرن هفدهم, مشاهده سلول مقدور نبود, زیرا سلول واحد بسیار کوچکی است که با چشم غیر مسلح قابل رویت نیست. روبرت هوک اولین بار در سال 1665 زیر میکروسکوپ ابتدایی که خود ساخته بود، سلولهای مرده را در برش های چوب پنبه مشاهده کرد. این سلولهای تو خالی و متصل به هم شکل اتاقکهای لانه زنبور را داشتند. چند سال بعد، طبیعت شناسی بنام آنتوان وان لون هوک سلولهای زنده را در قطره های آبی که از برکه برداشته بود، در زیر میکروسکوپ مشاهده کرد و آنها را جانوران کوچک نامید (شکل 1). او چند نمونه خشک شده خود را بین سالهای 1674 و 1687 به فرهنگستان سلطنتی لندن فرستاد. لون هوک بر روی هم توانست 419 میکروسکوپ و عدسی بسازد. او هر بار که عدسی یا میکروسکوپ بهتری می‌ساخت, می‌توانست میکروارگانیزمهای کوچکتری ببیند.

لون هوک در سال 1683 میلادی عدسی دیگری ساخت که می توانست اجسام بسیار ریز را نشان دهد. ایشان فکر می کرد که این اجسام بسیار ریز باید موجوداتی زنده باشند. ولی این اجسام به قدری کوچک بودند که فقط مثل نقطه ها و میله های کوچکی به نظر می آمدند. او نمی توانست عدسی دیگری بسازد که آنقدر قوی باشد که بتواند آنها را واضح نشان دهد. شاید به همین دلیل بود که آنتوان ون لون هوک به ناچار مطالعه این اجسام کوچک را، که بعدها باکتری نامیده شدند، رها کرد. باکتری از واژه ای یونانی به معنی میله کوچک گرفته شده است. لون هوک نخستین کسی بود که میکروبها را دید. سر انجام, درسال 1780 میلادی، فردریک مولر, زیست شناس دانمارکی کوشید تا باکتریها را برحسب اشکال متفاوت آنها به گروههای مختلف تقسیم کند. عدسیها برای اینکه اشیاء را بزرگتر از آنچه هستند نشان دهند پرتوهای نور را می شکنند, ولی همه رنگ های نور را به یک اندازه نمی شکنند. نور معمولی ترکیبی از چندین رنگ است. در سال 1830 میلادی, جوزف جکسون لیستر, عینک ساز انگلیسی که سر و کارش با ساختن عدسی بود, دو نوع عدسی را با هم ترکیب کرد. هر یک از آنها رنگها را به نحو متفاوتی می شکست، چنانکه یک عدسی تاثیرهای نامساعد عدسی دیگر را خنثی می کرد. به این ترتیب, ترکیب این دو نوع عدسی با یکدیگر سبب می شد که اشیاء کوچک به رنگ اصلی خود و بطور واضح نشان داده شوند. با بهبود روشهای میکروسکوپی, دانشمندان توانستند بافتهای گوناگون را بررسی کنند. اختراع میکروسکوپ تحول بزرگی در علم زیست شناسی بوجود آورد. با به کارگیری این ابزار قوی, بشر توانست اجسامی را که با چشم دیده نمی شوند، مشاهده کند.

بعد از گذشت چند قرن، میکروسکوپ همچنان نقش مهمی در پژوهش های زیستی ایفا می کند و در سالهای اخیر تحولات شگرفی در بهبود کیفیت آن صورت گرفته است. یکی از عمده ترین پیشرفتها در ساخت میکروسکوپ, اختراع نوع الکترونی آن در دهه 1940 بود که امکان مشاهده ذرات و اندامکهای درون سلولی را بهتر از گذشته فراهم کرد. در ضمن باید تاکید شود که امروزه میکروسکوپ نه تنها جهت بررسی شکل و ساختار نمونه های زیستی مورد استفاده قرار می گیرد, بلکه برای تعیین ارتباط بین ساختارهای تشکیل دهنده سلول و فعالیتهای گوناگون آنها نیز نقش به سزایی ایفا می کند.

میکروسکوپ مرکب نام دیگر میکروسکوپ نوری  است؛ چون بزرگنمایی میکروسکوپ، مجموع بزرگنمایی دو عدسی آن می باشد. عدسی شیئی (objective)  یکی از این دو عدسی و دیگری عدسی چشمی (ocular) می‌باشد. نام دیگر میکروسکوپ نوری،  زمینه روشن (Bright Field)  بوده و علت این نامگذاری این است که نور از میان قسمتی شفاف عبور می کند و زمینه اطراف شئ مورد مطالعه را روشن می نماید. در این میکروسکوپ، منبع نور دهنده، نور مرئی است. معمولا نور مرئی، از یک لامپ با تشعشع زیاد و یا یک آینه برای بازتاباندن نور به داخل میکروسکوپ استفاده می گردد.

هر میکروسکوپ از دو بخش مکانیکی و نوری تشکیل شده است.

1- بخش مکانیکی: در واقع قسمت هایی است که مستقیما در عبور و تشکیل تصویر نقش اصلی را به عهده ندارند و شامل کلیه بخش های نگه‌دارنده، حرکت دهنده و ثابت کننده یک میکروسکوپ می باشند، مانند پایه ، دسته ، صفحه پلاتین ، شاریو ، صفحه گردان ، پیچ های تنظیم (سریع و دقیق) ، گیره ها و لوله میکروسکوپ.

ـ پایه میکروسکوپ (Base): به اشکال نعلی ، مدور، مکعب مستطیلی و مانند آن ساخته می شود. جنس پایه معمولا از فولاد سنگین انتخاب می گردد تا از هر گونه لغزشی جلوگیری شود.

ـ دسته میکروسکوپ (Arm): برای جابجایی میکروسکوپ به کار می رود و معمو لا داسی و هلالی شکل است.

ـ پیچ های تنظیم: بر روی دسته میکروسکوپ قرار دارند. شامل پیچ تنظیم سریع (Coarse Focus) یا ماکرو متر و پیچ تنظیم دقیق(Fine Focus) یا میکرومتر می باشد. عمل آنها جابجا کردن لوله میکروسکوپ (در میکروسکوپ های قدیمی) در جهت بالا، پایین و بالعکس می باشد. در میکروسکوپ های جدید این پیچ ها  معمو لا صفحه پلاتین را در جهت بالا به پایین و بالعکس جابجا می کنند.

ـ صفحه میکروسکوپ (Stage): صفحه ای است فلزی یا کائوچویی که محل قرار دادن جسم مورد مطالعه می باشد. روی آن سیستمی به نام شاریوت (Chariot) پیش بینی شده است. شاریوت دارای دو بخش تیغه ای برای نگهداری نمونه است و نیز پیچ هایی در زیر صفحه قرار دارد که با چرخاندن آنها می توان نمونه را بر روی صفحه، و یا مجموعه نمونه و پلاتین را به چپ و راست یا به جلو و عقب حرکت داد.

ـ سیستم ورنیه: در دو بعد عمود بر هم پلاتین، دو سیستم ورنیه ای پیش بینی شده است که به کمک آنها می توان میزان جابجایی جسم در جهات مختلف و بازیابی منطقه ای خاص از جسم مورد مشاهده را انجام داد.

ـ صفحه گردان(Nose Piece): قطعه فلزی است، تقریبا به شکل مخروط ناقص که در سطح پایین آن تعدادی سوراخ تعبیه شده است.به هر یک از این سوراخها، یک لوله عدسی شیئی پیچ می شود. صفحه گردان در بالا به لوله میکروسکوپ متصل می گردد.

ـ لوله میکروسکوپ(Tube): در قسمت بالای آن اکولر (لوله عدسی چشمی) و در بخش پایین آن صفحه گردان قرار دارد. در بیشتر موارد طول لوله میکروسکوپ 16 سانتیمتر است.

2- بخش نوری: شامل سه بخش اساسی است: دستگاه روشنایی ـ ابژکتیو ـ اکولر

ـ دستگاه روشنایی: از دو بخش تشکیل شده است:

الف) منبع نور(Light Source): به طور معمول لامپ کوچک 6 تا 10 ولت است که اغلب در زیر پایه میکروسکوپ قرار دارد.

ب) کاندنسر(Condenser): از مجموعه ای از عدسی های محدب (کوژ) یا محدب الطرفین ساخته شده که عمل آنها همگرا کردن پرتو های نوری حاصل از منبع نور و تابانیدن آنها بر روی جسم است.

انواع کاندنسر(Condenser):

1- کاندنسر اب (Abbe Condenser): از مجموعه دو عدسی محدب (محدب الطرفین) ساخته شده است و  انحرافات کروی و رنگی (نوری) را تصحیح نمی کند. این کاندنسر در فاصله بین منبع روشنایی تا جسم و به طور معمول در زیر صفحه میکروسکوپ قرار دارد.

2- کاندنسر اپلاناتیک (Aplantic Condenser): این نوع کاندنسر دارای یک عدسی محدب بینابینی اضافی می باشد. کار این عدسی اضافی اصلاح انحرافات کروی است. با این کاندنسرها، انحرافات رنگی اصلاح نمی شود و برای اصلاح آن بایستی از نور تک رنگ استفاده کرد. این کاندنسر دقیق تر از نوع اول است.

برخی از اشکالات سیستم نوری:

انحرافات کروی: این گونه انحرافات ناشی از تحدب و کرویت عدسی ها می باشد. اگر یک دسته پرتوهای نوری موازی به یک سطح کروی(مثلا یک عدسی محدب) برخورد کند ، همه به یک میزان پراش نمی یابد. پرتو هایی که از مرکز می گذرند، بدون شکست پیش می روند. حال آنکه پرتوهایی که به محیط و کناره عدسی برخورد کنند پراش بیشتری دارند به این ترتیب هر چه شعاعهای نورانی به مرکز سطح کروی نزدیکتر باشند، شکست کمتری دارند و هر چه قدر از مرکز آن دور شوند، شکست بیشتری می یابند. پراش نابرابر همه پرتو های نورانی موازی را که به یک سطح کروی می رسند، انحرافات کروی نامند. کاندنسر های آپلانتیک با عدسی های محدب اضافی که دارند، موجب همگرایی بیشتر پرتو ها (کوچک شدن منطقه کانون) و در نتیجه یکنواختی بیشتر شدت روشنایی روی جسم می شوند.

انحرافات رنگی: تفکیک طیف های سازنده هر نور مرکب در برخورد با یک عدسی و شکست متفاوت آنها را اصطلاحا انحرافات رنگی نامند. این انحرافات از وضوح تصویر می کاهد. برای اصلاح آن از نور تک رنگ که فقط دارای یک طول موج خاص می باشد، استفاده می شود. نور تک رنگ را می توان با استفاده از فیلترهای رنگی به دست آورد.

فیلتر ها(صافی های نور): فیلتر ها، صفحات شیشه ای رنگین، تیره رنگ یا مشبکی هستند که از آنها برای ایجاد روشنایی یکنواخت ، پراکندگی نور و بالا بردن تضاد استفاده می شود. از آنجا که هر فیلتری طیف همرنگ خود را عبور می دهد و بر عکس از عبور طیف های مکمل رنگ خود جلوگیری می کند، با استفاده از فیلترهای رنگی می توان تک رنگ دلخواه و مناسب برای هر مشاهده  میکروسکوپی را فراهم ساخت. هنگام مشاهده میکروسکوپی با میکروسکوپ های فاز متضاد و زمینه تاریک که نمونه های مورد بررسی رنگ نشده اند، به کارگیری یک فیلتر سبز رنگ موجب سهولت مشاهده می شود. با استفاده از فیلترهای پلاریزان در زیر لام و بر روی عدسی چشمی می توان نور را پلاریزه به دست آورد که در مطالعه دانه های نشاسته و مواد بلوری در سلولهای جانوری و گیاهی، کوتیکولهای گیاهی ، مو، پشم و سایر فیبر های طبیعی و فیبرهای عضلانی کاربرد بسیار دارد.

دیافراگم(Diaphragm): وسیله تنظیم شدت نور میکروسکوپ است و جزء بخش مکانیکی است. هر میکروسکوپ به طور معمول دارای دیافراگم زمینه، دیافراگم کاندنسر و دیافراگم اکولر است. دیافراگم زمینه میزان نوری را که از منبع روشنایی به کاندنسر می رسد، تنظیم می کند و معمولا در بالای منبع روشنایی قرار دارد. دیافراگم کاندنسر ، شدت نوری را که از کاندنسر گذشته و به جسم می رسد تنظیم می کند و اغلب در زیر کاندنسر قرار دارد. دیافراگم اکولر بر حسب نوع اکولرها، در داخل لوله اکولری و یا قبل از عدسی شیئی اکولر قرار دارد.

دیافراگم انواع مختلفی دارد:

الف) دیافراگم ساده (Simple Diaphragm): صفحه ای فلزی یاکائوچویی دارای چند سوراخ با قطر های متفاوت است که با افزایش درشت‌نمایی ابژکتیو، سوراخ وسیعتر دیافراگم در مسیر نور قرار می گیرد تا نور مورد نیاز تامین شود.

ب) دیافراگم آیریس (Iris Diaphragm): این دیافراگم همانند مردمک چشم امکان تنگ وگشاد شدن را دارد. از تعدادی صفحات نازک انعطاف پذیر و قابل لغزش برروی هم ساخته شده است. انطباق صفحات نازک برروی هم با باز شدن سوراخ میانی و عبور نور بیشتری همراه است.

ج) دیافراگم حلقوی (Annular Diaphragm): این دیافراگم دارای حلقه هایی با قطر متفاوت برای عبور نور است. ساختمان آن به نحوی است که از عبور پرتو های نوری مرکزی جلوگیری می کند و پرتو های محیطی را که پراش بیشتری پیدا می کنند به جسم می تاباند. از این نوع دیافراگم، در میکروسکوپ فاز متضاد استفاده می شود.

د) دیافراگم زمینه تاریک یا هلالی (Dark Field Diaphragm): این نوع دیافراگم از عبور پرتوهای نوری مرکزی جلوگیری می کند ، و فقط پرتوهای نوری کناری از دو منطقه تقریبا هلالی شکل عبور کرده و به کاندنسر می رسد.

عدسی شیئ (Objective): هر ابژکتیو اساسا از تعدادی عدسی تشکیل شده است. عمل کلی ابژکتیو تشکیل اولین تصویر از جسم است. این تصویر بزرگتر از جسم، معکوس و حقیقی است. ابژکتیو مهمترین بخش نوری هر میکروسکوپ است. طول عدسی های شیئی با یکدیگر متفاوت است. عدسی کوچکتر ، عدسی با بزرگنمایی ضعیف تری است، در حالی که عدسی بزرگتر ، عدسی ای با بزرگنمایی قوی تر می باشد. عدسی های ابژکتیو جنس های مختلفی دارند از جمله کرون، فلینت، فلئورین و کوارتز.

 

 

 

 

ابژکتیو ها را بر حسب روش به کارگیری ، ترکیب عدسی و کارآرایی آنها به شرح زیر تقسیم بندی می کنند:

1- بر حسب روش به کارگیری: ابژکتیو ها را به دو نوع خشک (Dry objective) و ایمرسیون (Oil immersion) نام گذاری می کنند: وقتی محیط شفاف بین جسم و ابژکتیو هوا باشد، ابژکتیو را اصطلاحا ابژکتیو خشک می نامند و اگر این فاصله به وسیله مایعی (آب ، گلیسیرین ، روغن سدر ،آلفا برمونفتل و مانند آن) پر شود، ابژکتیو را ایمرسیون می گویند. در درشتنمایی های بالا که به نور بیشتری نیاز است، از شرایط ایمرسیون استفاده می شود که ضمن آن مایع موجود در فاصله بین نمونه و ابژکتیو کار یک عدسی محدب را انجام می دهد و پرتو های نوری را کانونی و همگرا می کند و به ابژکتیو می رساند و به این ترتیب از هدر رفتن آنها پیش گیری می کند.

2-  بر حسب ترکیب و کارایی عدسی ها:

الف ـ ابژکتیو آکروماتیک: انواع مختلف شیشه از لحاظ  درجه شکست رنگهای مختلف با یکدیگر تفاوت دارند. در ابژکتیو های آکروماتیک عدسی هایی را که از ترکیب شیشه های مختلف ایجاد شده اند به صورت مجموعه های دوتایی (مقعر، محدب) به کار می گیرند. در ابژکتیو های آکروماتیک با استفاده از ترکیب عدسی های دارای جنس وتحدب متفاوت (عدسی های مقعرو محدب)، پرتوهای قرمز و آبی را در یک کانون جمع آوری کرده و از مجموعه آنها ، طیف سبز مایل به زرد را می سازند که در چشم بیشترین حساسیت را ایجاد می کند. این نوع عدسی ها را عدسی های دارای سیستم دو تایی می نامند.

ب ـ ابژکتیو آپوکروماتیک: در این ابژکتیو ها ترکیب عدسی های مختلف به نحوی است که مجموعه ای از طیف های آبی، سبز و قرمز هم کانون می شوند و به این ترتیب مقدار زیادی از انحرافات رنگی اصلاح می گردد. عدسی های به کار گرفته شده در ابژکتیو های آپوکروماتیک معمولا ساختمان سه تایی دارند. این ابژکتیو ها به ویژه برای عکس برداری‌های میکروسکوپی مناسبند و در میکروسکوپ های دقیقتر کاربرد دارند. نوع دیگری از ابژکتیو ها به نام ابژکتیو فاز مخصوص میکروسکوپ های فاز متضاد وجود دارد.

درشت نمایی ابژکتیو: نسبت اندازه تصویر به اندازه جسم را درشت نمایی هر سیستم نوری گویند.

فاصله کانونی ابژکتیو با درشت نمایی آن نسبت عکس دارد و هر چه درشت نمایی بیشتر شود، فاصله کانونی کمتر می شود.

عدسی چشمی (Ocular): اکولر ها در مجموع کار یک ذره بین را انجام می دهند. اکولر از تصویر ایجاد شده به وسیله ابژکتیو ، تصویری مجازی، مستقیم (معکوس نسبت به جسم اولیه) و بزرگتر درست می کند.

 

تشکیل تصویر در میکروسکوپ: تشکیل تصویر در میکروسکوپ از قوانین تشکیل تصویر در عدسی های محدب پیروی می کند. ابژکتیو از جسم تصویر اول را می سازد که تصویر حقیقی ، بزرگتر و معکوس است. اکولر همانند ذره بین، از این تصویر، تصویر نهایی را که مجازی، بزرگتر و مستقیم است، می سازد.

اصطلاحات:

توان تفکیک یا قدرت تمیز میکروسکوپ (Resolution Power): کوچکترین فاصله قابل تشخیص بین دو نقطه واقع بر یک سطح را که به وسیله‌ی یک سیستم نوری، قابل رؤیت باشد، توان تفکیک آن سیستم گویند. هر چه مقدار عددی توان تفکیک کمتر باشد، توان تفکیک دستگاه نوری بیشتر است.

بزرگنمایی (Magnification): میزان بزرگتر نمایش دادن تصویر نسبت به جسم را بزرگنمایی گویند.

تضاد (Contrast): به ایجاد سایه روشن و تضاد در نمونه های میکروسکوپی کنتراست گفته می شود. کنتراست را به راههای مختلف در نمونه های بیولوژیکی می توان بوجود آورد و تنظیم نمود تا قسمت های مختلف نمونه با وضوح بیشتری قابل تشخیص شود.

سوالات:

1- دلیل استفاده از روغن ایمرسیون چیست؟

2- دلیل استفاده از لامل برای مشاهده نمونه چیست؟

3- انواع شیشه هایی که در ساخت عدسی به کار می روند، نام برده و کاربرد آنها را بنویسید.

4- هر دور پیچ ماکرو معادل چند دور پیچ میکرو است؟

5- اعداد روی لوله های عدسی شیئ نمایانگر چه مفاهیمی می باشند؟

 

ارایه نتایج مربوط به مشاهدات میکروسکوپی همراه با رسم شکل و نامگذاری و پاسخ سوالات مربوط به همان جلسه به همراه گزارش کار انجام شده در آزمایشگاه در جلسه بعد ضروری است و عدم ارایه آن به معنای عدم کسب بخشی از نمره پایان ترم می باشد.

 

شاد و پیروز باشید