آزمایشگاه سلولی-جلسه چهارم
ساعت ۱٠:٤٥ ‎ب.ظ روز ۱۳٩۱/۱/۱۸  کلمات کلیدی:

برای مشاهده به ادامه مطلب بروید


تکنیک های جداسازی اجزای سلولی و تفکیک آنها، جزء به جزء کردن سلول های خون و بررسی شیب غلظت

 

  • ·        آشنایی با روش تفکیک سلول ها یا اجزاء درون سلولی با استفاده از شیب غلظت
  • ·        تفکیک اجزاء تشکیل دهنده بافت خونی
  • ·        بررسی شیب غلظت و اجزاء تفکیک شده

 

استاد راهنما: فاطمه کاظمی

 

 

 

آخرین مرحله مطالعات سلول شناسی، جدا کردن اجزای یک بافت می باشد که محققین می توانند با این کار به خصوصیات مورفولوژی، عملکردی و سیتولوژی یک جزء مورد نظر برسند. حتی می توان با این روش به خصوصیات عملکردی برخی از آنزیمها پی برد. با تکنیک های شیمی بافتی و شیمی سلولی هم می توان تحقیقات را کاملتر کرد. تکنیک های جداسازی اجزای سلولی شامل مراحل زیر است:

1-    هموژناسیون یا همگن سازی بافت و تهیه عصاره سلولی: این عمل برای هر بافتی می تواند صورت بگیرد. مثلا برای جداسازی میتوکندری از کبد به صورت ایزوله یا برای بافت گیاهی، کلروپلاست را از سلول های پارانشیمی مزوفیلی برگ اسفناج استخراج می کنند و یا آن که بافت خونی را با روش خاص خود جدا کرده و روی آن مطالعه میکروسکوپی انجام می دهند. این عمل می تواند برحسب نوع بافت، مدل آن از لحاظ ساختاری و شرایط آسیب پذیری بافت از نظر فیزیکی و شیمیایی انجام شود. این روش می تواند مکانیکی باشد یا توسط هموژنایزرهای دستی و برقی و یا به روش سائیدن و خرد کردن در هاون چینی صورت گیرد. هم چنین می توان توسط امواج ماورای صوت نمونه را خرد کرد و یا یک روش آنزیمی به کار برد تا نمونه توسط آنزیم های هضم کننده و لیز کننده، تخریب شده و بتوان به جزء مورد نظر رسید. برای حذف ساختاری خاص از درون سلول، می توان از روش آنزیمی استفاده نمود. برای مثال هنگامی که می خواهیم جزء خاصی از باکتری را خارج کنیم در حالتی که دیواره سلولی مزاحم است، بدون آسیب رساندن به سلول باکتری توسط آنزیم، دیواره را خارج می کنند.

2-     صاف کردن نمونه با عبور سوسپانسیون سلولی از صافی چندلایه مثل پشم شیشه یا صافی     پارچه ای: برای مثال جدا کردن بخش های اضافی در سلول های جانوری از جمله بافت های      هم بند و رگها و یا در بافت های گیاهی از جمله آوندهای ظریف.

3-    جداسازی و تفکیک اجزاء با استفاده  از نیروی گریز از مرکز یا سانتریفیوژ بر اساس شکل، اندازه و دانسیته یا چگالی اجزاء. این عمل می تواند به دو روش انجام شود:

  1. سانتریفیوژ در شیب غلظت(Density gradiant centrifugations) که یا به روش شیب غلظت پیوسته و یا ناپیوسته صورت می گیرد.

      اگر شیب غلظت پیوسته باشد، برای ساخت شیب غلظت توسط دستگاهی به صورت زیر عمل می کنند: در این دستگاه از یک لوله به لوله دیگر آب عبور می کند و از یک لوله نیز سوکروز اشباع 100% وارد می شود که در لوله نهایی مخلوط می شوند که در نهایت شیب غلظتی از 100%-0 داریم. در این حالت نمونه را در این شیب قرار می دهند و اجزای سلولی تحت نیروی گریز از مرکز با دور و زمان معین جدا می شوند.

شیب غلظت نا پیوسته جزئی از شیب غلظت پیوسته است و در این شیب، نمونه در بخش های خاص جدا می شود.

     2.سانتریفیوژ افتراقی یا مرحله به مرحله(Differential centrifugations): در این روش در یک مرحله یک جزء را جدا کرده و در مرحله بعد عصاره را در محلول خاص خود            ( محلول بافری مناسب معین) جدا می کنیم. در این حالت اجزای سلولی در زمان ها و در دورهای معین به ترتیب وزن ملکولی جدا می شوند.

در سانتریفیوژ در شیب غلظت، اجزای سلولی بر اساس چگالی خاص خود از هم جدا می شوند. سوسپانسیون سلولی در لوله سانتریفیوژ(حاوی ترکیبی است که غلظت آن در طول یک لوله یکسان نیست.) قرار می گیرد و به علت تفاوت در غلظت محلول در طول لوله، چگالی در بالای لوله کمتر و در پایین لوله بیشتر می باشد. در طی عمل سانتریفیوژ هر جزء از عصاره سلولی به مکانی مشخص در لوله که چگالی آن مساوی با چگالی آن قسمت باشد، منتقل می شود و با وجود ادامه چرخش در همان دور مشخص، دیگر حرکت نمی کند. به این نحو اجزای عصاره سلولی در بخش های متفاوت لوله توزیع و بر حسب چگالی خاص خود از هم جدا می شوند. در شیب غلظت پیوسته، غلظت در طول لوله سانتریفیوژ به طور پیوسته تغییر می کند و بی نهایت باند غلظتی بوجود می آید. در شیب غلظت ناپیوسته غلظت های متفاوت و با تعداد محدود در طول لوله سانتریفیوژ وجود خواهند داشت.

 

مواد و وسایل مورد نیاز:

لوله آزمایش، پی پت پاستور، سرنگ، آب مقطر، محلول سوکروز با غلظت های متفاوت(100، 75، 50، 25)، خون تام، لام، لامل، میکروسکوپ

روش کار:

در این آزمایش با استفاده از شیب غلظت ناپیوسته به روش سانتریفیوژ در شیب غلظت، سلول های سازنده بافت خونی را از هم تفکیک خواهیم کرد. چون بافت خونی به صورت سوسپانسیون است، لذا مرحله تهیه عصاره سلولی و عبور از صافی را نخواهیم داشت.

در این آزمایش 6 لوله داریم که یکی حاوی آب مقطر و یک لوله حاوی سوکروز اشباع 100% و سه لوله برای غلظت های 75، 50، 25 درصد است و یک لوله برای تهیه شیب کنار می گذاریم.

شماره لوله

حجم محلول اشباع سوکروز (cc)

حجم آب (cc)

درصد اشباع محلول سوکروز (%)

1

2

0

100

2

5/1

5/0

75

3

1

1

50

4

5/0

5/1

25

5

0

2

0

 

مثال:: محلول 75%: cc5/1 سوکروز اشباع + cc5/0 آب

لوله ها را مشخص می کنیم و ابتدا توسط سرنگ بدون سوزن cc2 در انتهای لوله نهایی می ریزیم. سوزن را برای ریختن باندها روی هم استفاده می کنیم تا مخلوط نشود. در مرحله بعد سرنگ را از محلول 75% پر کرده و با چسباندن به لوله نهایی و با زاویه، قطره قطره محلول را روی لایه زیرین 100% ای سوار می کنیم و به همین ترتیب لوله نهایی را از محلول های بعدی پر می کنیم. سپس چند قطره خون در لوله نهایی ریخته و نمونه را در سانتریفیوژ  در دور 1000(RPM) به مدت 3 دقیقه قرار می دهیم.

پس از اتمام این مدت زمان دو روش زیر را انجام می دهیم:

1)     مشاهده عینی نمونه: به این صورت که باند شفاف رو قرار گرفته و چند باند رنگی در وسط و رسوب قرمز در ته لوله دیده می شود.

2)     توسط پی پت پاستور، سه قطره مجزا بدون تکان دادن لوله روی لام می گذاریم: ابتدا یک قطره از محلول رویی برداشته  و در گوشه ای از لام می گذاریم. سپس پی پت پاستور را داخل کرده و از اولین ناحیه رنگی وسط یک قطره برمی داریم. در آخر پی پت پاستور را تا انتها پایین برده  و با نوک آن رسوب را بر هم می زنیم. سپس یک قطره از سلول های حل شده را روی لام می گذاریم. روی هر قطره لامل گذاشته و مشاهده  می کنیم. نمونه های سلولی مربوط به هر لایه برداشت شده را با هم مقایسه و  همراه با شکل تحلیل و تفسیر کنید.

سوالات:

1-    چرا در بین سلول های هر قسمت سلول های متفاوتی نیز وجود دارد؟

2-    انواع مختلف دستگاه سانتریفیوژ را نام برده و در رابطه با هر کدام توضیح مختصری ارائه دهید.

 

ارایه نتایج مربوط به مشاهدات میکروسکوپی همراه با رسم شکل و نامگذاری و پاسخ سوالات مربوط به همان جلسه به همراه گزارش کار انجام شده در آزمایشگاه در جلسه بعد ضروری است و عدم ارایه آن به معنای عدم کسب بخشی از نمره پایان ترم می باشد.

شاد و پیروز باشید