آزمایشگاه سلولی-جلسه پنجم
ساعت ٩:۳۳ ‎ب.ظ روز ۱۳٩۱/۱/٢٥  کلمات کلیدی:

برای مشاهده به ادامه مطلب بروید


استخراج و خالص سازی کلروپلاست از سلول گیاهی و مشاهده غیرمستقیم پراکسی زوم ها

استاد راهنما: فاطمه کاظمی

 

  • ·        تهیه بافر استخراج مناسب جهت استخراج کلروپلاست
  • ·        آشنایی با روش هموژناسیون مکانیکی یا فیزیکی
  • ·        استفاده از تکنیک سانتریفیوژ افتراقی جهت جداسازی اندامک های درون سلولی
  • ·        تهیه لام خالص و سالم از کلروپلاست های ایزوله شده
  • ·        مشاهده غیرمستقیم پراکسی زوم و بررسی مکانیسم اثر آنزیم های این اندامک

 

از روش های جزء به جزء کردن سلول ها برای استخراج و جداسازی کلروپلاست نیز می توان استفاده کرد. بافر استخراج مناسب در این آزمایش محلول 0/4 مولار سوکروز است. در سانتریفیوژ مرحله به مرحله، سوسپانسیون حاصل از هموژن کردن بافت، در محلول بافری حاوی غلظت معینی از سوکروز با سرعت های مختلف، مرحله به مرحله سانتریفیوژ شده تا اندامک های سلولی بر اساس تفاوت در شکل، اندازه و وزن از هم جدا شوند. کم کم در مراحل بعد سرعت سانتریفیوژ افزایش می یابد تا خالص سازی نهایی صورت بگیرد. در سرعت پایین و زمان کم، کمترین نیرو به عصاره سلولی وارد و بزرگترین و سنگین ترین اجزای سلولی ته نشین می شوند و اجسام سبکتر در محلول رویی(سوپر ناتانت) قرار می گیرند. با سانتریفیوژ مجدد، سوپرناتانت در میدان قوی تری قرار گرفته و به ترتیب اجزای بیشتری از هم جدا می شوند. بنابراین مرحله به مرحله جداسازی انجام می شود.

این آزمایش به چند دلیل در سرما انجام می شود: برای حفظ ساختار اندامک، کاهش فعالیت آنزیم ها، حفظ ساختار غشاها.

سلول طبیعی را ایزوله کرده و مراحل بعدی را روی آن انجام می دهیم. ایزوله کردن برای جداسازی اجزای مزاحم مانند رگبرگ می باشد. پس از هر سانتریفیوژ افتراقی دو جزء داریم: محلول رویی(super natant) و بخش رسوب کرده. پس از مرحله اول سانتریفیوژ یک قطره از رسوب را با بزرگنمایی 40 مشاهده می کنیم. محلول رویی دوم را نگه داشته و کلروپلاست را تازه سازی می کنیم. برای خالص سازی با همان دور قبلی مجددا سانتریفیوژ انجام می دهیم. محلول رویی در سانتریفیوژ آخر، بافر می باشد. پس از سانتریفیوژ روی محلول رویی، پراکسید هیدروژن(H2O2) می ریزیم و لوله را پر از حباب های اکسیژن می بینیم که نشانه وجود پراکسی زوم در این محلول است. یک قطره از رسوب خالص سازی شده از کلروپلاست را توسط پی پت پاستور روی لام گذاشته و با قرار دادن لامل با بزرگنمایی 40، سلول ها را مشاهده می کنیم. کلروپلاست برای جذب نور بیشتر به سطح سلول می آید. در برخی سلول ها با تغییر پیچ میکرو، می توان کلروپلاست ها را در زیر واکوئل ها مشاهده کرد. علاوه بر کلروپلاست، کرک های ستاره ای و هم چنین تزئینات دیواره ای ثانویه به شکل مارپیچی دیده می شود.

مواد و وسایل مورد نیاز:

سانتریفیوژ، سمپلر، پراکسید هیدروژن، پی پت پاستور، برگ تازه اسفناج، محلول 0/4 مولار سوکروز، هاون، صافی، لام، لامل، میکروسکوپ

روش کار:

  1. برگهای تازه اسفناج را چند بار با آب شسته، سپس داخل کیسه پلاستیکی به مدت چند ساعت قبل از آزمایش در یخچال قرار می دهیم و باقی مراحل جداسازی را در سرما و در دمای 4- درجه سانتیگراد انجام می دهیم تا ساختار کلروپلاست به طور کامل حفظ و فعالیت آنزیم ها حداقل شود.
  2.  رگبرگها و دمبرگها را جدا کرده و برگها را وزن می کنیم.
  3.  به ازای هر گرم وزن برگ 2ml محلول بافری( بافر فسفات 0/06M با  PH=6/5،سوکروز 0/4 مولار) اضافه می کنیم. سپس مخلوط برگها و محلول بافری را در هاون چینی می سائیم تا یک سوسپانسیون نسبتا هموژن بدست آید.
  4.  سوسپانسیون بدست آمده سبز رنگ را از بین پارچه صافی چندلایه عبور می دهیم. محلول سبز رنگ را به مدت 2 تا 3 دقیقه در RPM 1300-1200)200g ) سانتریفیوژ می کنیم تا هسته ها و سلول ها شکسته شده و رسوب کنند.
  5. محلول رویی را جدا کرده و به مدت 10 دقیقه در RPM 3400-3200)g 1000) سانتریفیوژ می کنیم تا کلروپلاستها ته نشین شوند. محلول رویی شامل اندامک های سبک از جمله ریبوزوم، پراکسی زوم، میتوکندری، لیزوزوم و غشاهای جزئی می باشد.
  6. در مدت انجام سانتریفیوژ مرحله 5، یک قطره از رسوب مرحله قبل( مرحله 4) را توسط پی پت پاستور بر روی لام گذاشته، لامل گذاری می کنیم و در بزرگنمایی 40 مشاهده می نماییم. تمام موارد مشاهده شده از جمله: آوندهای چوبی نوع اول مارپیچی و حلقوی، آوند آبکش، کرک های تک سلولی ساده و غده ای، کریستالهای گیاهی قبه ای، منشوری، دانه شنی، داربست یا دیواره سلولی پاره شده، سلول های نردبانی و اسفنجی پارانشیمی و ... را شناسایی و شکل آنها را رسم و نامگذاری کنید.
  7. پس از پایان سانتریفیوژ مرحله 5، سوپرناتانت را در لوله ای تمیز ریخته و جهت بررسی وجود یا عدم وجود پراکسی زوم ها نگه دارید و رسوب کلروپلاست را در محلول بافری تازه واجد سوکروز هموژن کنید و در همان دور RPM 3400-3200 ) 1000g) به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ مجدد می کنیم. این روش را در صورت لزوم تا خالص سازی کلروپلاست 3-2 بار تکرار می کنیم.
  8. در مدت زمان انجام سانتریفیوژ فوق، سوپرناتانت حاصل از مرحله 7 را که حاوی اندامک های سبکتر از کلروپلاست از جمله پراکسی زوم ها هستند، با افزودن چند قطره آب اکسیژنه (H2O2) از لحاظ وجود یا عدم وجود پراکسی زوم ها مشاهده، بررسی و تفسیر کنید.
  9. در مرحله آخر آزمایش، یک قطره از رسوب کلروپلاست را در محلول بافری تازه هموژن کنید و با لامل گذاری زیر میکروسکوپ مشاهده کنید.
  10. کلیه تصاویر میکروسکوپی را که در طول آزمایش مشاهده کردید، رسم و نامگذاری کنید.

طرز تهیه بافر فسفات:

دی هیدروژن سدیم فسفات

NaH2Po4

0/7گرم

دی سدیم هیدروژن فسفات

Na2HPo4

0/3گرم

آب مقطر

H2O

100 میلی لیتر

 

موارد فوق را به نسبت ذکر شده مخلوط کرده و PH را به کمک دستگاه PH متر به 6/5 می رسانیم. محلول را در ظرفی دربسته در یخچال نگه داشته و هنگام مصرف با آب مقطر 6 بار رقیق می کنیم.

طرز تهیه سوکروز4/0 مولار:

سوکروز

0/4 مولکول گرم

گرم 136/8= 0/4 × 342

آب مقطر

1000 میلی لیتر

 

 

جهت تهیه محلول بافری سوکروز به جای آب مقطر، سوکروز را با بافر به حجم دلخواه می رسانیم.

 

سوالات:

1)     پس از اضافه کردن آب اکسیژنه برای بررسی پراکسی زوم، دمای لوله آزمایش چه تغییری می کند؟چرا؟

2)     آیا شکل عمومی همه کلروپلاست ها یکسان است؟چرا؟

3)     در سلول گیاهی سالم، موقعیت کلروپلاست نسبت به سایر اجزای سلول چگونه است؟چرا؟

4)     توضیحی مختصر در مورد کلروپلاست و پراکسی زوم بنویسید.

 

 

ارایه نتایج مربوط به مشاهدات میکروسکوپی همراه با رسم شکل و نامگذاری و پاسخ سوالات مربوط به همان جلسه به همراه گزارش کار انجام شده در آزمایشگاه در جلسه بعد ضروری است و عدم ارایه آن به معنای عدم کسب بخشی از نمره پایان ترم می باشد.

شاد و پیروز باشید