آزمایشگاه سلولی-جلسه هفتم
ساعت ٩:٤٠ ‎ب.ظ روز ۱۳٩۱/٢/۸  کلمات کلیدی:

برای مشاهده به ادامه مطلب بروید


کالیبراسیون میکروسکوپ و اندازه گیری ابعاد سلول در واحد سطح

استاد راهنما: فاطمه کاظمی

 

 

یکی از راههای شناخت گونه های مختلف موجودات زنده(یوکاریوت و پروکاریوت) اندازه گیری دقیق سلول و اندامک های درون سلولی است. اندازه هر سلول در یک بافت مشخص نه تنها در پیکر موجودات مختلف بلکه در پیکر یک موجود نیز ممکن است متفاوت باشد. پس دانستن اندازه یک سلول در بافت های مختلف به تشخیص سلول و محل آن در بافت مخصوص، هم چنین در تشخیص حالات غیرعادی(بزرگ و یا کوچک شدن سلول و یا توقف رشد سلول) که ممکن است برای سلول اتفاق بیفتد کمک می نماید. از این امر می توان پی به وجود بیماری در نمونه برد. از روش اندازه گیری ابعاد جهت اندازه گیری و شناسایی برخی اندامک ها مانند میتوکندری، هسته و پلاستها نیز استفاده می گردد.

در میکروسکوپ نوری برای اندازه گیری ابعاد سلول از میکرومتر چشمی یا اکولر مدرج                     (Eye Piece Micrometer) و میکرومتر صفحه ای یا لام مدرج (Stage Micrometer) استفاده می شود.

اکولر مدرج: رایج ترین روش اندازه گیری ابعاد در میکروسکوپ نوری استفاده از اکولر مدرج است. این اکولر نوعی عدسی چشمی است که جایگزین عدسی چشمی در میکروسکوپ می شود. این عدسی دارای خطی است که به صد قسمت مساوی تقسیم شده است و خطوط تقسیم آن شماره گذاری شده است، اما واحد مشخص و ثابتی ندارد. بنابراین از لام مدرج استفاده می شود.

لام مدرج: لامی همانند لام های معمولی است که در میان آن دایره سیاه رنگی دیده می شود که برای دسترسی آسان به خط مدرج میانی لام روی آن قرار دارد. در داخل دایره خطی به طول یک میلی متر وجود دارد که به صد قسمت مساوی تقسیم شده است اما بدون شماره گذاری است. پس کوچکترین تقسیم بندی در این لام برابر 01/0 میلی متر یا 10 میکرون است.

دقت شود که هرگز مواد پاک کننده مانند گزیلن روی این خط کشیده نشود زیرا باعث پاک شدن آن می شود.

می توان به جای لام مدرج از لام هموسیتومتر نیز استفاده نمود.

 وسایل و مواد مورد نیاز:

لام مدرج، اکولر مدرج، میکروسکوپ، بشره پیاز

روش کار:

برای کالیبره کردن این عدسی در بزرگنمایی های مختلف، عدسی چشمی را خارج کرده و اکولر مدرج را جایگزین آن کنید. لام مدرج را روی صفحه میکروسکوپ قرار دهید و با تنظیم کنتراست مناسب در بزرگنمایی 4 و سپس 10 بخش مدرج لام را بیابید. سپس با چرخش اکولر مدرج و حرکت لام طوری دو درجه بندی را برهم منطبق کنید که از سمت چپ صفحه، اولین درجه لام مدرج دقیقا در راستای اولین درجه اکولر مدرج باشد. این دو درجه را با پیچ های تنظیم به هم نزدیک کنید. طول تقسیمات دو میکرومتر با هم مساوی نیست. در بزرگنمایی 10 از سمت راست، دو درجه ای را که دقیقا با هم انطباق دارند، شمرده و حساب کنید که یک درجه از اکولر مدرج معادل چند میکرون است؟ هر درجه از لام مدرج که شمرده می شود باید در 10 ضرب شود تا با توجه به توضیحات لام مدرج بر حسب میکرون بدست آید. این اندازه را معادل تعداد درجه شمرده شده از اکولر مدرج قرار داده و در تناسب یک درجه از اکولر محاسبه کنید. عددی که بدست می آید عدد کالیبره اکولر مدرج در بزرگنمایی 10 است، یعنی فاصله یک درجه از اکولر مدرج در بزرگنمایی 10 چند میکرون است. عدد کالیبره با بزرگنمایی نسبت عکس دارد و هم چنین عدد کالیبراسیون هر میکروسکوپ با میکروسکوپ دیگر متفاوت و برای عدسی های شیئ مختلف نیز متفاوت است.

به همین ترتیبی که گفته شد عدد کالیبره را برای بزرگنمایی های مختلف بدست آورید.

اندازه گیری ابعاد سلول در واحد سطح

برای این حالت پس از بدست آوردن عدد کالیبره برای عدسی 10، اپیدرم پیاز را جدا نموده(نمونه ضخیم یا چروکیده نباشد) و آن را به همراه یک قطره آب روی لام معمولی قرار دهید و لامل گذاری نمایید. با بزرگنمایی 10 مشاهده نمایید. نمونه را بر روی صفحه جابجا کنید تا یکی از درجات اکولر مدرج مماس بر سلول قرار گیرد. سپس تعداد درجاتی را که طول سلول را پوشش می دهند، شمرده و یادداشت نمایید.

طول سلول(میکرون) = عدد کالیبره عدسی موردنظر × تعداد درجات پوشش دهنده طول سلول

به دلیل اینکه در اندازه گیری با جمعیتی از سلول ها از نظر اندازه روبرو هستیم، بنابراین طول 10 سلول را به طور تصادفی اندازه گیری کرده و با کمک دو فرمول زیر میانگین و انحراف معیار اندازه گیری را بدست می آوریم.


سپس طول واقعی سلول و انحراف معیار واقعی سلول را از روابط زیر محاسبه کنید:

طول واقعی سلول(میکرون) = عدد کالیبره عدسی موردنظر × عدد میانگین طول سلول

انحراف معیار واقعی سلول(میکرون) = عدد کالیبره عدسی موردنظر × عدد انحراف معیار

 

 

                               نمایی از درجات اکولر مدرج

 

     نمایی از روش منطبق کردن لام مدرج و اکولر مدرج در میدان دید میکروسکوپ

  

          

اندازه گیری طول سلول های بشره پیاز پس از کالیبراسیون

 

مناطق مشخص شده با علامت فلش مربوط به خطوط موازی عمودی لام هموسیتومتر جهت تعیین واحد کردن اکولر مدرج می باشند.

 

 نمایی از روش منطبق کردن میکرومتر چشمی و میکرومتر صفحه ای در میدان دید میکروسکوپ

  سوالات:

1-    در میکروسکوپ الکترونی برای اندازه گیری ابعاد از چه چیز استفاده می شود؟

2-    چرا درجات اکولر مدرج دارای مقیاس مشخص و ثابتی نیست؟

3-    عدد کالیبره عدسی های 10 و 40 را بدست آورید.

 

ارایه نتایج مربوط به مشاهدات میکروسکوپی همراه با رسم شکل و نامگذاری و پاسخ سوالات مربوط به همان جلسه به همراه گزارش کار انجام شده در آزمایشگاه در جلسه بعد ضروری است و عدم ارایه آن به معنای عدم کسب بخشی از نمره پایان ترم می باشد.

شاد و پیروز باشید